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肿瘤浸润免疫细胞检测

肿瘤中数量最多的细胞是肿瘤细胞，免疫细胞的比例只能占到其中很小的一部分，因此如何高效率的分离肿瘤浸润的免疫细胞成了实验的关键，所幸，目前优德官网地址已经试验过了一套可以高得率提取肿瘤浸润免疫细胞的protocol，实验操作分为肿瘤分离、制备肿瘤细胞悬液，percoll分离免疫浸润淋巴细胞，细胞染色，上机分析这五个部分。

   肿瘤分离

1. 采用颈椎脱臼法将荷瘤小鼠处死，放置于含有75%酒精的烧杯中，浸泡30s。

2. 左手持镊子，右手持弯剪，沿肿瘤边缘剪下长约1cm的口子，可清晰看见肿瘤附着于皮下，沿着肿瘤边缘轻轻剪开连接处，剥离肿瘤。

3. 将剥离的肿瘤放入100mm的培养皿中，并在室温下加入5-10 ml的HBSS。

注：肿瘤体积一般不超过1000mm3，肿瘤质量在0.6-0.8g之间。

   制备肿瘤细胞悬液

4. 待所有肿瘤剥离完毕后，将肿瘤转移至1.5ml EP管中，手持弯剪将肿瘤剪碎。

5. 将肿瘤组织悬液转移到50ml离心管中，用适量HBSS冲洗EP管，并将悬浮液转移到离心管中。管中的总体积为45ml。

6. 在管中加入5ml 10×Triple Enzyme Mix，在摇床上以80rpm、37℃的条件消化1-3小时。

7. 消化完毕后，50g，10min离心，收集上清，则为肿瘤细胞悬液。

注：剪刀剪碎肿瘤的标准为，其可被1ml的枪头自由吸取，无阻碍。

10×Triple Enzyme stock solution (100 ml)

在80 ml HBSS中混合1 g Collagenase IV, 100 mg Hyaluronidase和20,000 Units DNase IV，添加HBSS至100ml。使用0.22μm的滤器进行过滤，分装成5ml储存在-20℃，使用前恢复至室温。

   Percoll分离免疫浸润淋巴细胞

8. 200×g，5min离心上清，加入10ml HBSS重悬，将其转移至15ml离心管中，200g，5min再次离心，用40% percoll重悬细胞。

9. 在新的15ml离心管中提前加入4ml 80%percoll，再用巴氏滴管小心的沿壁将4ml含肿瘤细胞的40% percoll沿壁加在80%percoll的上面。

10. 350g，30min离心（升速=1，降速=0），40% percoll与80% percoll交界处则为免疫细胞。

Fig 2. 不同浓度的percoll分离免疫细胞

04 细胞染色

11. 收集细胞，加入10ml PBS 350g，5min离心。

12. 100μl PBS重悬，转移到1.5ml EP管中，进行封闭。

13. 使用相应的抗体，与细胞一起共孵育。

   上机分析

细胞分析的marker表达：

多色流式分析淋巴系亚群（T/Th/Tc/B/NK/Treg）的比例。